IVD企業(yè)必爭之地“分子POCT”這是你知道的POCT嗎？

POCT（Point-of-care Testing），又稱為即時檢測，其定義為在采樣現(xiàn)場進行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到檢測結(jié)果的一種檢測方式。1995年P(guān)OCT概念首次提出，POCT的出現(xiàn)能夠在快速取得檢測結(jié)果的同時免去了樣本的處理和數(shù)據(jù)分析等繁瑣的步驟，也不必再依賴于專業(yè)人員的操作，因此POCT 在醫(yī)療中的應(yīng)用迅速增加，小至自我測試和門診，大至重癥監(jiān)護病房，POCT 已應(yīng)用在了各種醫(yī)療場合中。

世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）要求新建立的 POCT 方法應(yīng)符合“ASSURED”標準，即經(jīng)濟實惠（Affordable）、靈敏度高（Sensitive）、特異性好（Specific）、操作簡單（User-friendly）、快速并可重復(fù)（Rapid and Robust）、無需儀器（Equipment-free）和易獲取（Delivered (to the end user)）。該標準首次提出于 WHO 的熱帶疾病研究和培訓特別項目（WHO Special Program for Research and Training in Tropical Diseases），同時POCT 應(yīng)在實驗室和醫(yī)院外由非實驗室人員進行。

目前，POCT 不僅可用于血糖檢測和早期妊娠的檢測，還可用于心血管疾病、急慢性腎病、酸堿紊亂、感染性疾病、血液病、凝血功能障礙等方面的檢測。常用的POCT技術(shù)早期主要以定性檢測為主，包括膠體金、免疫層析、干化學技術(shù)等。后期隨著技術(shù)的發(fā)展以及對檢測結(jié)果需求的逐步提升，以免疫熒光、上轉(zhuǎn)發(fā)光、化學發(fā)光、微流控技術(shù)等為核心的POCT產(chǎn)品快速發(fā)展并逐步應(yīng)用于臨床，實現(xiàn)了快速的定量檢測，提高了準確性。

核酸分子檢測方法??

核酸分子檢測相對于抗原抗體檢測在準確性、靈敏度、特異性方面具有明顯優(yōu)勢。一場新冠疫情更是凸顯了其在傳染性疾病防控方面發(fā)揮著不可替代的作用。除了PCR之外，常見的核酸檢測方式還有以下幾種：

1、依賴核酸序列的擴增NASBA

1991年Jean Compton首次提出NASBA，該方法以單鏈RNA為模板，在41℃恒溫條件下，通過逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶以及正向引物和反向引物來模擬體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病的的復(fù)制機制進行目標RNA的擴增。90分鐘內(nèi)可以獲得10的12次方倍產(chǎn)物，其產(chǎn)物長度在100到250個堿基，靈敏度最高達單個拷貝。

2、滾環(huán)擴增RCA

RCA是一種在37℃下進行的恒溫擴增反應(yīng)，具體過程為一條鎖式探針與靶序列雜交后其在連接酶作用下連接成環(huán)，引物與環(huán)狀模板匹配后在Phi29 噬菌體DNA聚合酶作用下沿環(huán)延伸并不停置換先前產(chǎn)生的互補序列，最終產(chǎn)生重復(fù)的長單鏈DNA。1小時內(nèi)其單一引物可產(chǎn)生1000倍放大效果。在此基礎(chǔ)上通過在產(chǎn)物上引入一至多條引物形成超支化RCA、將產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后再連接成環(huán)作為RCA模板、將產(chǎn)物重復(fù)片段切開后作為新的引物引發(fā)RCA擴增等手段均可實現(xiàn)RCA產(chǎn)物指數(shù)級的擴增。

3、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增LAMP

LAMP由Tsugunori Notomi等人于2000年首次發(fā)表，針對模板六個特異性區(qū)域設(shè)計的一對外引物F3、B3和一對內(nèi)引物FIP、BIP在具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst ，LavaLAMP等）作用下沿模板發(fā)生延伸和置換的循環(huán)。在60~65℃條件下1小時內(nèi)可以獲得10的9次方倍的擴增產(chǎn)物，靶序列的最佳長度在130-200 bp，最佳靈敏度大于10拷貝。在此基礎(chǔ)上，可以通過額外引入一對環(huán)狀引物可顯著提升其檢測靈敏度并加速反應(yīng)進程將時間縮短至30分鐘內(nèi)。可通過雙鏈嵌合染料對其產(chǎn)物進行實時檢測，經(jīng)終點法瓊脂糖凝膠電泳對其產(chǎn)物進行檢測時其電泳條帶呈梯形。后來又陸續(xù)開發(fā)出了多種LAMP檢測方法如比濁法、鈣黃綠素法、羥基萘酚藍、pH響應(yīng)顯色、側(cè)流層析等。

4、解旋酶依賴性擴增HDA

在體內(nèi)，DNA通過解旋酶、DNA聚合酶及各種輔助蛋白因子進行復(fù)制，Vincent等人模仿這一過程開發(fā)出了體外的解旋酶依賴性擴增法。該方法原理，首先DNA雙鏈被DNA解旋酶（E. coli UvrD helicase）分離為單鏈并分別被單鏈結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合，之后兩條上下游特異性引物分別與模板雜交，在DNA聚合酶（exo- Klenow）的作用下延伸，合成新的雙鏈。在37℃條件下反應(yīng)1-2小時可獲得10的6次方倍的擴增產(chǎn)物，其靶序列在400 bp范圍內(nèi)可以得到有效擴增。后來有研究稱可以將UvrD解旋酶與Bst-DNA聚合酶偶聯(lián)構(gòu)成一種雙功能蛋白，可顯著提升HDA反應(yīng)速率，并可實現(xiàn)長達2.3kb的片段擴增。

5、重組酶聚合酶反應(yīng)RPA

2006年P(guān)iepenburg等人首次介紹了RPA反應(yīng)，目前該方法已有成熟商業(yè)化試劑盒推出市場。基礎(chǔ)的RPA反應(yīng)主要有三種酶參與，包括重組酶（T4 uvsX）、聚合酶（Bsu）和單鏈結(jié)合蛋白（gp32）以及兩條特異性的上下游引物。具體擴增機理如下，首先T4 uvsX在輔助因子uvsY的作用下與引物結(jié)合形成核酸蛋白復(fù)合物，之后該復(fù)合物尋找與靶標DNA的互補區(qū)域進行雜交并置換下另一條單鏈，該單鏈馬上被gp32結(jié)合防止其再與互補鏈雜交。接下來與引物結(jié)合的T4 uvsX在ATP的作用下解離，引物在聚合酶Bsu作用下沿模板鏈延伸。該反應(yīng)在37-42℃下反應(yīng)，30分鐘內(nèi)可以獲得10的12次方倍拷貝的擴增產(chǎn)物。其擴增長度在500bp以內(nèi)最佳。

平臺類型??

標準分子生物學實驗室具有嚴格的功能分區(qū)，包括核酸提取區(qū)、試劑準備區(qū)、擴增區(qū)及產(chǎn)物分析區(qū)，qPCR的發(fā)展應(yīng)用可使擴增區(qū)與產(chǎn)物分析區(qū)合并，但仍然需要較大的實驗室空間，而且對實驗室的通風條件、負壓條件及樣本與人員流動方向都具有一定的要求。除了實驗室條件外，分子實驗的操作及結(jié)果的判讀分析也具有一定的專業(yè)性，需要投入較大人力。使得常規(guī)的分子生物實驗室的設(shè)立具有較高門檻，難以在各級診療機構(gòu)全面開展。面對各級醫(yī)療機構(gòu)對于核酸檢測的需求甚至個人自測的需求，各式的核酸檢測POCT產(chǎn)品應(yīng)運而生。受最適的應(yīng)用場景、檢測通量、檢測成本的影響，不同廠家在開發(fā)分子POCT平臺時具有不同的側(cè)重點，因此所呈現(xiàn)的最終的產(chǎn)品形態(tài)也是百花齊放。

1、無儀器分子POCT

如Lucira Health新冠試劑中的檢測單元組件包含多個反應(yīng)腔室，可檢測新冠N基因的兩個非重疊區(qū)域，同時設(shè)置有一個陽性內(nèi)部質(zhì)控(Positive Internal Control, PIC)和一個裂解內(nèi)部質(zhì)控(Lysis Internal Control, LIC)。采集樣本后的拭子在樣本管洗脫液作用下，于室溫裂解釋放核酸；核酸進入檢測單元的不同反應(yīng)腔室，執(zhí)行RT-LAMP反應(yīng)；反應(yīng)過程會導(dǎo)致體系pH值改變，并可通過顯色劑呈現(xiàn)出顏色變化；檢測單元內(nèi)置的光電元件實時檢測反應(yīng)體系的顏色變化，從而對檢測結(jié)果進行判讀；由于反應(yīng)過程是實時檢測的，陽性結(jié)果可在11分鐘內(nèi)顯示、陰性或無效結(jié)果則需在30分鐘后顯示。

2、微流控分子POCT

博奧將微流控技術(shù)與恒溫擴增技術(shù)完美結(jié)合，滿足當前臨床診斷、食品安全等快檢領(lǐng)域高通量、經(jīng)濟、高效的需求。最快 20 分鐘即出結(jié)果，與 PCR 多孔板擴增相比，反應(yīng)體系小，操作更簡便，靈敏度可達10-1000拷貝。

3、自動化分子POCT

Automolec 3000，不僅把核酸提取、純化、擴增、檢測集成到了一臺機器上，還做到了“樣本隨來隨檢”。突破了以前高通量一體機只能按批量檢測的限制, 單個樣本隨來隨檢，首個結(jié)果100分鐘，之后2分鐘出一個結(jié)果，可實現(xiàn)200測試/8小時，多項目同時載機測試，適用多樣本類型。

分子POCT上游組件??

為實現(xiàn)上述各種形態(tài)的POCT產(chǎn)品，需要依托完整的工業(yè)體系，包括電子信息、機械工程、微流體通路設(shè)計、光學設(shè)計等，此外還有材料、化學、生物等的支持。

液路模塊是分子POCT產(chǎn)品最具挑戰(zhàn)的核心技術(shù)之一，常見的有管式、卡盒式、盤式、以及微流控芯片式。其中微流控芯片更是對當前最先進工藝的整合，其基質(zhì)從無機材料到有機材料均有覆蓋。而不同材料所制備的芯片往往適用于不同功能的生化分析需求。同時，不同材質(zhì)在加工方面的難易程度也成為人 們選擇芯片基質(zhì)的一個重要原因。最初的微流控芯片基質(zhì)是半導(dǎo)體行業(yè)中所常用的硅片，可通過干法刻蝕或濕法刻蝕進行加工成型，在硅片表面形成不同的通 道與分區(qū)來實現(xiàn)不同功能。雖然硅片不具透光性，導(dǎo)致多數(shù)基于光學的生化分析或熒光成像檢測難以應(yīng)用于硅質(zhì)芯片，但是可通過在芯片特定結(jié)構(gòu)部分添加金屬相來進行電化學檢測，或者與透明材質(zhì)如玻璃的混用來解決光學檢測的問題。

由于玻璃具有良好的光透過性，具有很低的熒光背景，而且可通過硅羥基在玻璃表面輕易進行多種修飾改性，因此玻璃逐漸替代硅成為主要的無機硬質(zhì)微流控芯片材質(zhì)，同樣可采用濕法刻蝕或干法刻蝕進行微結(jié)構(gòu)的加工。但是無論是以硅還是玻璃作為芯片的基質(zhì)，其加工制作工藝難度相對較大，需要大型儀器設(shè)備，成本較高，并不利于一次性檢測芯片的推廣應(yīng)用，而且開發(fā)準入門檻較高，也限制了其發(fā)展。因此更多的實驗室將芯片的研發(fā)聚焦于有機材料如 PDMS，此類材料借助陽模可直接注塑成型，能夠顯著降低單個樣本的檢測成本。

生物制劑則是液路系統(tǒng)之外另一核心技術(shù)。不同于常規(guī)分子診斷試劑，為了適配POCT的需求，反應(yīng)所需的生物酶、dNTP、鹽離子緩沖介質(zhì)等往往需要預(yù)載到卡盒或芯片的個功能腔室內(nèi)，而預(yù)載試劑的卡盒由于具有較大體積，且受卡盒基質(zhì)、預(yù)載試劑的多樣性如磁珠等特性的影響，以及儲存運輸成本的限制，一般需要進行4℃或常溫存放，這就對試劑的穩(wěn)定性和耐熱性提出了嚴格要求。